T细胞增殖功能测定

基础理论:本技术用于评估T细胞对各种刺激的增殖能力。T细胞增殖能力是反映T细胞功能的一个重要指标。

刺激T细胞增殖的因素及意义

1. 特异性抗原： 引起寡克隆活化增殖。克用于判断抗原免疫的效果（疫苗接种）和回忆反应能力，也能反映T细胞总体的功能。

2. 丝裂原：多克隆。

3. 刺激信号转导分子：多克隆。

T细胞增殖测定方法

1. 显微镜下观察细胞形态与细胞计数。

2. 放射性核素掺入试验。

细胞增殖时，DNA复制，须从培养液中补充核苷酸。用放射性核素标记培养液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），当DNA复制时， 3HTdR掺入正在分裂的细胞的DNA中。细胞增殖程度与细胞内掺入的3HTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定培养细胞中的放射性强度，就可以确定T细胞增殖的能力与强度。

丝裂原诱导的增殖反应

诱导T细胞增殖反应的丝裂原

1. PHA（植物血凝素）

2. Con A（刀豆蛋白 A）

3. PMN（美洲商陆）

技术方法

影响因素

单向混合淋巴细胞培养反应

原理：T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。

将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。

单向混合淋巴细胞培养试验

方法

（实验组cpm－阴性对照组cpm）

RR＝—————————————————

阳性对照组cpm－阴性对照组cpm

注意点

抗原诱导的特异性增殖反应

原理:本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。

方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）

结果解释

注意点

B细胞产生抗体能力的测定

基础理论:B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定B细胞功能的最重要的方法。B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以，B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源于T细胞缺陷。

丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定

基础理论:人B细胞具有PWM受体，在体外受到PWM刺激时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞产生抗体的能力可以用ELISA测定培养上清中抗体的量估计，也可以用ELISPOT方法测定产生抗体的B细胞数量估计。

技术方法与评价

应用实践

注意点:采用以抗体为基础的技术（如磁珠法、淘洗法和流式细胞仪）分离的B细胞，需考虑抗体对B细胞产生抗体的影响（促进或抑制作用）。

ELISPOT法

基础理论:ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验（enzyme－linked immunospot assay），可用于测定产生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。

技术方法

评价

应用实践:用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。

ELISA测定各类免疫球蛋白

基础理论:B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然后在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗，结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类别。

方法

评价:ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中Ig的首选方法。碱性磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外产生的抗体。

应用实践:ELISA可测定各种体液中的抗体，其结果反映被检个体B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的水平有助于鉴定免疫缺陷病。

CTL杀伤功能的测定

基础理论:CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8＋T细胞识别APC表面MHCI类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。

1. 细胞接触机制

CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞死亡。

2. 细胞裂解机制

CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜爱细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。

51Cr标记法原理

如在将靶细胞与CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育，51Cr能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢固结合，不能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被CTL破坏后，51Cr被释放进入上清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，通过测定上清中放射性强度，就可以判定CTL杀伤能力。

技术方法

NK细胞毒性测定

基础理论:NK细胞存在于外周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为丰富。因细胞体积大和胞浆内含大量颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。表型特征是CD16（FcRIII A）和CD56（神经细胞粘附分子）。当NK细胞识别肿瘤细胞活病毒感染细胞时，CD16分子被交联，引起脱颗粒，并分泌IFN－和TNF。颗粒中含有穿孔素、颗粒酶和proteoglycans，引起靶细胞溶胀性死亡和凋亡。NK细胞的CD16与IgG1和IGg3结合，可介导ADCC作用。

NK细胞表达一种能识别HLA－A、－B、－C抗原的受体，向细胞发出一致性信号，阻止NK细胞的杀伤活性。当靶细胞不表达或低表达HLAI类分子时，抑制解除，NK细胞活化，杀伤靶细胞。

K562细胞系不表达HLA分子，对NK细胞杀伤作用敏感，常用作NK细胞的靶细胞，用于检测NK细胞的活性。

技术方法

评价

LAK细胞毒性测定

基础理论

LAK细胞是淋巴因子激活杀伤细胞的简称。NK细胞在大剂量IL－2刺激下扩增并分化成为LAK细胞。LAK细胞对新鲜分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系具有非特异性杀伤作用。临床上用LAK细胞过继性治疗某些肿瘤患者，例如肾细胞癌、黑色素瘤合霍奇金病，有一定疗效。

技术方法

应用实践

1.用于检测NK细胞的功能：正常人NK细胞在大剂量IL－2作用下能够分化成为LAK细胞。NK细胞功能缺陷者，分化能力降低。检测LAK细胞活性可以作为衡量NK细胞功能活性的指标。

2.检测LAK细胞的细胞毒性：预测LAK细胞功能活性。